Cold atmospheric plasma: egy erőteljes eszköz a modern orvoslás számára

A hideg atmoszférikus plazma alkalmazása klinikai tanulmányokban főként a krónikus sebek kezelésére korlátozódik, de most már számos orvosi területre történő alkalmazás a sok elemzés célja. Ezért valószínű, hogy alkalmazási spektruma a jövőben bővülni fog. A hideg atmoszférikus plazma képes a mikrobás terhelés csökkentésére, anélkül hogy ismert volna jelentős negatív hatás az egészséges szövetekre, és ez növelheti annak lehetséges alkalmazhatóságát bármely mikrobiális fertőzés helyszínén. Továbbá kimutatták, hogy daganatellenes hatással is rendelkezik. Emellett sejtek proliferációját serkenti, ideértve az őssejteket és más tenyésztett sejteket is, és a rendkívül növelt nitrogén-monoxid szinteknek nagyon fontos hatása van ebben a szaporodásban. A hideg atmoszférikus plazma használata előnyös hatással lehet az immunterápiára a rákbetegek esetében. Végül lehetséges, hogy a plazmaberendezések használata nem marad korlátozva a felszíni szerkezetekre, mivel a jelenlegi erőfeszítések arra irányulnak, hogy kellően kisméretű mikroplazma berendezéseket fejlesszenek ki, ami nagy valószínűséggel vezet az alkalmazásukhoz a bőr alatt és a belső szerkezetekben is. Ez a tanulmány összefoglalja a rendelkezésre álló irodalmat a hideg plazma hatásmeghatározó mechanizmusairól, és annak jelenlegi in vivo és in vitro alkalmazásairól, elsősorban a regeneratív és fogászati orvoslás, valamint az onkológia területén.

Bevezetés

William Crookes 1879-ben alapozta meg a plazma tudomány alapjait azáltal, hogy kísérletek során ionizált gázt hozott létre egy elektromos kisülés csőben, magasfeszültség alkalmazásával egy tekercsen keresztül. Az ionizált gázt ragyogó anyagnak nevezték. A jelenlegi "plazma" kifejezést majdnem ötven évvel később, 1927-ben Irvin Langmuir vezette be [1]. Azóta a plazmát számos területen alkalmazzák az elmúlt évtizedek során, köztük az orvoslásban [2,3,4]. A plazmát gyakran ionizált gázként határozzák meg, amely a poliatómás gázok molekuláinak bomlásával vagy az elektronok eltávolításával az egymolekuláskori gázok héjából keletkezik [5]. Azonban nem minden ionizált gázt lehet plazmaként tekinteni a következő szigorú meghatározás miatt [5,6,7]: (1) A plazmának makromolekuláris semlegességet (kvázi-semlegességet) kell mutatnia. A plazma külső zavarok hiányában a nettó eredményezett elektromos töltés nulla. Ezért a plazma tartalmazza (majdnem) ugyanazok sűrűségű pozitívan és negatívan töltött részecskéket; (2) A plazmának rendelkeznie kell Debye árnyékolással, ahol a plazma töltött részecskéi hatékonyan elrendeződnek, hogy áramszűrő mezőket hozzanak létre a Debye hossz távolságon belül. Ez a Debye hossztávolságként van meghatározva, és azt mutatja, milyen távolságra hat az egyes töltött részecske elektromos mezőjének befolyása a plazma belső töltött részecskéire; (3) Plazma frekvencia. Ha a plazma elveszti egyensúlyi feltételeit, akkor a belső térterek olyan kollektív részecskemozgást ösztönöznek, amely visszaállítja az eredeti töltéssemlegességet. Ezt a mozgást a plazmafrekvenciaként hivatkozó természetes rezgési frekvenciával jellemezhetjük. A plazmát ezért "egy kvázi-semleges gázként definiálhatjuk, amely sok kölcsönhatásba lépő szabad elektront és ionizált atomokat és molekulákat tartalmaz, amelyeket a hosszútávú Coulomb erők okozta kollektív viselkedés jellemez" [7]. Ezenkívül a plazmában a töltött részecskemozgás elektromos mezőket és áramokat hoz létre, valamint mágneses mezőket generál [6].

A plazmát magas hőmérsékletre, hőmérsékletre és hőmérsékleten kívül csoportokra is lehet osztani [7,8]. A magas hőmérsékletű plazmában minden részecske (elektronok és nehéz részecskék) azonos hőmérsékletű, és ezért hőegyensúlyban vannak. A hőmérsékleti (kvázi-egyensúlyi plazma) csak a plazmán belül lévő hőmérsékleti egyensúly területei. Végül a nem-hőmérsékleti (nem-egyensúlyi) plazmában olyan részecskék találhatók, amelyek nincsenek hőegyensúlyban. Ezt a plazmát "hideg plazmának" nevezik [7,8].

A magas hőmérsékletű vagy hőmérsékleti plazmák magasabb elektronsűrűséggel és ionizációval rendelkeznek, mint a hideg plazma, amelynek ionizációja csak akár 1% -ig terjed [5,6,7]. A gyengén ionizált plazmákban a töltéssemleges kölcsönhatások dominálnak a többszörös Coulomb-kölcsönhatások terén [6]. Emellett bár az elektron-elektron ütközések hőegyensúlyt érnek el a hideg plazmában, és a hőmérsékletük akkor sokkal magasabb, mint az ionok és neutronok hőmérséklete, nem tudják átadni kinetikus energiájukat nagyobb részecskéknek [6].

A magas hőmérsékletű plazma elérheti a 108 K-t, mint a napmagban talált. A hőmérsékleti plazma hőmérséklete körülbelül 2 × 104 K lehet, és ezt az értéket viharvillámokban figyelhetjük meg. Végül a nem hőmérsékleti plazma hőmérséklete 300 és 1000 K között lehet mesterségesen létrehozott körülmények között, például fénycsövekben [8,9]. A hideg plazma kibocsátása elérhető alacsony nyomáson és légköri nyomáson is [2,3,10].

Az alacsony nyomású hideg plazmát először az 1960-as évek végén alkalmazták felületek fertőtlenítésére, és bizonyos szempontból hatékonyabbnak bizonyult, mint a hagyományos sterilizálás [11]. Ezzel szemben a hideg atmoszférikus plazma (CAP) előnyei a mikrobás terhelés csökkentésében csak a 1990-es évek második felében kerültek felfedezésre [12,13]. Azonban a CAP jobb alternatívát nyújt a modern orvoslás számára, mint a hideg plazma alacsony nyomáson generált változata. A CAP alkalmazása könnyebb folyamat is, mint az alacsony nyomású plazma, mivel hordozható eszközből generálható, ami lehetővé teszi a fertőzött sejtek és szövetek könnyebb elérését, mint amit az alacsony nyomású hideg plazma igényelő nagy vákum generáló rendszer biztosít. Emellett a legtöbb alacsony nyomású plazmát generáló rendszer nagyon költséges [11]. Emellett gyakorlatilag lehetetlen bármely testrészét a rendszerbe helyezni és kitéve lenni a plazmakibocsátásnak. Ráadásul az állati és emberi szövetekben víz található, és jelenléte nem kívánatos alacsony nyomású körülmények között [11]. Végül bár az alacsony nyomású plazmakibocsátást lehet szabályozni, jellege nagyon eltérő és erősebb, mint az atmoszférikus nyomáson létrehozott plazma kibocsátása, és általában nem alkalmas emberi vagy állati sejtek vagy szövetek alkalmazására. Az alacsony nyomáson generált hideg plazma azonban hasznos lehet az orvoslásban. Példák erre a "flash-sterilizáció", implantátumok és szövetmérnöki termékek felületmódosításainak felhasználása [11].

Bár a CAP nem éri el az alacsony nyomású plazma sterilizációs és fertőtlenítési lehetőségeit [11], továbbra is hatékony a mikrobás terhelés csökkentésében [14,15]. Legfontosabbként a CAP kevésbé intenzív hatásai lehetővé teszik a közvetlen alkalmazását a sejtekre és szövetekre [3,4], és a mikrobás terhelés csökkentési képessége lehetővé teszi, hogy jó alternatívát jelentsen az antibiotikumok helyett, és szembeszálljon a növekvő antibiotikum rezisztenciával rendelkező baktériumtörzsekkel [3]. 

A plazma kibocsátás elsősorban az UV sugárzás kialakulásával, a reaktív oxigén (ROS) és nitrogén (RNS) vegyületek kialakításával, valamint az elektromos áram kialakításával csökkenti a baktériumok életképességét [4,16,17,18,19,20,21,22]. A plazma kibocsátás által létrehozott oxigén alapú vegyületek közé tartozik a hidroxil (OH), hidrogén-peroxid (H2O2), szuperoxid (O2−•), hidroxil radikális (•OH), singulett oxigén (1O2) és ózon (O3) [23,24]. A nitrogén alapú vegyületek közé tartozik a nitrogén-monoxid (•NO), a nitrogén-dioxid (•NO2), a dinitrogén tetroxid (N2O4), a nitrogén-trioxid (NO3), a nekrózis-oxid (N2O) és a peroxinitrit (ONOO-) [23,24]. A reaktív vegyületek létrehozhatók a plazma-lég kölcsönhatás vagy a plazma-folyadék kölcsönhatás révén. Míg a hidroxil radikálisok és a nitrogén-oxidok általában a plazma-lég kölcsönhatás eredményeként képződnek, a nitritek, nitrátok és H2O2, amelyek hosszabb élettartamúak, a plazma-folyadék kölcsönhatás eredményeként képződnek [23,24]. Például ez utóbbi kölcsönhatás akkor fordul elő, amikor a tenyésztőközegben található sejteket plazmának teszik ki [25]. Emellett a CAP pozitív töltésű ionokat, például N2+-ot is generál [22], és elektronokat is [20].

Azonban a prokarióták, baktériumsejtek különböznek az eukarióták emberi és állati sejtektől, és a daganatsejtek különböznek az egészséges sejtektől. Ezenkívül az összes sejt eltérően viselkedhet in vitro körülmények között, és eltérően reagálhat a sejtekre az élő szervezet szövetekben. Ez azt hangsúlyozza, hogy a CAP eszközök különböző válaszok lehetőségét kínálják ezekben a sejttípusokban, valamint az in vitro és in vivo körülmények között [26]. Azonban általában úgy vélik, hogy a kis dózisú plazmakezelés serkenti a sejtek életképességét, és fokozza a proliferációt, differenciálódást és migrációt, míg a nagy dózisok sejtapoptózist kellene kiváltaniuk [26].

A klinikai gyakorlatban használt plazmaeszközök kialakításra kerültek annak érdekében, hogy ne veszélyeztessék az egészséges sejteket. Többlépcsős teszteken mennek keresztül, és jelenleg nincsenek jelentős mellékhatásokkal összefüggésben [4,27,28]. Azonban a megfelelő CAP adagolást a klinikai gyakorlatban szorosan szabályozni kell, és ez a kezelés típusától függ. Például a plazmaforrás és a kezelendő objektum közötti távolságot gondosan be kell állítani. Itt Nastuda és munkatársai. [29] kimutatták, hogy a plazmajet alkalmazásának hatása jelentősen változhat, akár egy centiméteres különbség is lehet a csőfej és az emberi bőr között. A szerzők számottevő különbségeket találtak a plazma terjedésében és az áram áramlásában az emberi szöveteken keresztül, amikor a bőr-csőfej rés közét 15 mm-ről 5 mm-re csökkentették. Emellett nem zárható ki, hogy a CAP alkalmazásnak nincs néhány minimális negatív hatása a molekuláris szinten. Ezek az eredmények és lehetőségek mind folyamatos elemzés tárgyai, de a jelenlegi eredmények azt sugallják, hogy a be nem bizonyított káros hatások a CAP sok előnyével szemben állnak [3,4,12]. Végül valószínű, hogy a CAP klinikai gyakorlatban történő alkalmazására vonatkozóan további lehetőségek és nagyobb előnyök mutatkoznak majd a jövőben, mivel a CAP tanulmányok többsége az utóbbi 15 év során zajlott [3,4,12]. Míg a CAP alkalmazható esztétikai eljárásokban [30,31,32], itt összefoglaljuk a CAP alkalmazást komolyabb orvosi állapotok esetében. Ezek különösen magukban foglalják az akut és krónikus sebeket, valamint a szájüregi bakteriális fertőzéseket és daganatterápiát. Ezzel párhuzamosan felfedezzük a plazma potenciálját a regeneratív orvoslásban és a biológiai mérnöki alkalmazásokban.

A klinikailag alkalmazott és kísérletileg tesztelt CAP eszközöket három fő kategóriába sorolják: 1.) azok, amelyek közvetlen kibocsátáson alapulnak, 2.) azok, amelyek közvetett kibocsátáson alapulnak, és 3.) hibrid típusok [4,33,34].

A közvetlen dielektromos gáthozadék-kibocsátás (DBD) magasfeszültség-elektród és egy földelt elektród között történik. Az elektrodok mindkettő vagy egyenként dielektromos réteggel lehetnek borítva, vagy a dielektromos anyag a két elektród közötti térben helyezkedhet el. A DBD eszközöket csak váltakozó vagy pulzáló magasfeszültséggel szabad feltölteni a kapacitív kapcsolódás biztosítása érdekében. Az elektromos mező hatása alatt a dielektromos gát "megállítja" az elektronokat és ionokat az elsődleges gázfelbontás után. Az ionok és elektronok elektromos mezője eltakarja a külső forrás elektromos mezőjét. Ha ez az állapot fennmarad, az kibocsátásveszteséghez vezet, és az kibocsátás megőrzése érdekében módosítani kell a külső feszültséget. A felbomlás akkor következik be, amikor növekvő váltakozó áramfeszültséget alkalmaznak, és a kibocsátási tevékenység megszűnik, amikor a maximális feszültséget eléri. Továbbá a pulzussal működő DBD-k alkalmazásakor két felbomlás következik be ugyanabban a periódusban. Az elsődleges felbomlást a magasfeszültségű impulzus okozza, és a töltéshordozó által létrehozott elektromos mező elegendő az újabb felbomlás kiváltásához a feszültség csökkenése közben. Ez egy "visszafelé történő kibocsátás" formájában jelentkezik [35,36,37]. A DBD eszközöknek számos variációja és kialakítása van, és az egyik legpraktikusabb és a legalkalmasabb a gyógyászati alkalmazásra a lebegő elektródos DBD (FE-DBD). Műszakilag a FE-DBD eszközök nem tartalmaznak földelt elektrodát, és ezt érintett sejtek vagy szövetek váltják fel. A DBD eszközök nagyobb intenzitást és rugalmasabb és kontrolláltabb kibocsátást biztosítanak. Emellett képesek plazmát generálni csak levegőben, és nincs szükség hordozógázokra. Azonban a kibocsátási terület viszonylag korlátozott, mivel annak két elektród között kell elhelyezkednie, és a konstans távolságot fenn kell tartani; ez sima, lapos felületet igényel [4,33,34].

A közvetett kibocsátás olyan eszközökkel történik, amelyeket általában Plazma sugár, Plazma toll vagy Plazma láng néven emlegetnek. Ezek az eszközök hasonlók a közvetett kibocsátású eszközökhöz abban, hogy két egymással szemben lévő elektromosan töltött elektromos kibocsátást generálnak közöttük, de itt a hordozógáz irányítja a plazma kibocsátást. Ennek eredményeként a kibocsátás nem érinti az objektumot az elektrodok között, hanem a gázáram irányába halad. Ennek következtében a céleszközt kívül helyezhetik el az eszközön, és az érintett terület állítható. Kevesebb ROS és RNS vegyületet termel, és a kibocsátás nehezebben ellenőrizhető, mint a DBD eszközökkel. Végül a közvetett eszközök által generált plazma erősebb minden UV tartományban, de ellentétben a DBD eszközökkel, nem állít elő elektromos áramot.

A hibrid plazmaeszközök ezeket az elveket kombinálják, de jelenleg csak kísérleti szinten alkalmazzák őket. Ezek az eszközök egy földelt hálózatelektrodán mikrofelbomlásokat hoznak létre. Egységes kibocsátás van, nincs hatás az elektrodok közötti objektumra, és az eszközt viszonylag könnyű ellenőrizni. Azonban ezek az eszközök enyhén hajlamosabbak az alkatrész kopására és a későbbi romlásra. Ez különösen észrevehető nedves környezetben és közvetlen érintkezés után a kezelt sejtekkel és szövetekkel [4,33,34].

Az orvosi gyakorlatban használt plazma eszközök között három specifikus típus található, amelyek az orvosi gyakorlatban lettek tanúsítva [11]. Az első hitelesített eszköz a kINPen® MED plazma toll (INP Greifswald/neoplas tools GmbH, Greifswald, Németország) volt. A második a PlasmaDerm® VU-2010 DBD eszköz volt, amely dielektromos plazma kibocsátási technológián alapul (CINOGY Technologies GmbH, Duderstadt, Németország), és a legújabb hitelesített eszköz a SteriPlas plazma láng eszköz (Adtec Ltd., London, Egyesült Királyság). Azonban több módosítással rendelkező eszközt is teszteltek laboratóriumi és kísérleti körülmények között, és várnak az esetleges klinikai alkalmazásra történő hitelesítésre.

Végül maga a plazma alkalmazása közvetlen és közvetett is lehet. A közvetlen plazma alkalmazás során a sejtvonalaknak in vitro kitéve vannak a plazma kibocsátásnak, az állatmodellek és az emberi szövetek a kibocsátásnak vannak kitéve in vivo. Ezzel szemben a plazma által érintett vagy aktivált közeg vagy oldat közvetett alkalmazásra kerül. Ezután a sejtnövekedéshez használják vagy közvetlenül beadható a vizsgált személyekbe, például egér xenograftokba [38]. Emellett a hosszú távú vegyületek, ideértve a nitrátokat, nitriteket és H2O2-t, általában megőrzésre kerülnek a plazma-aktivált közegben (PAM) [39].

A hideg atmoszférikus plazma használata rákos sejtekre

CAP ígéretes lehetőség a hatékonyabb tumorkezelésre. Azonban annak végső hatása a ráksejtekre igen érdekes. A ráksejtek nagyobb mennyiségű ROS és RNS előállításával rendelkeznek, és bár ez fokozza a proliferatív aktivitásukat, még magasabb szintek az apoptózist okozhatják [104]. A CAP ezután ezt a szintet olyan magasra növeli, amely halálos a ráksejtek számára. Ennek a hatásnak oka a ráksejtek antioxidáns rendszerében bekövetkező változások és a kettős szálú szakadásokban keresendő, de az egészséges sejteknek el kell viselniük ezt az emelést [92]. A tumor sejteknek több aquaporinja is van [105], ami megkönnyíti a ROS és RNS behatolását a sejtbe [106]. Az ROS és RNS diffúziójának mértékét a membrán lipidszerkezete is befolyásolhatja [107]. A ráksejtek általában alacsonyabb koleszterinszinttel rendelkeznek, ami növeli a sejtek érzékenységét a peroxidációval szemben [108,109]. A membrán lipidek peroxidációja ezt követően a sejthártya több pórus kialakulásához vezet, hogy az ROS és RNS nagyobb mértékben tudjon diffundálni [109]. Az eljárás alkalmazásának mechanizmusainak összefoglalása azt mutatja, hogy különböző sejtválaszokat indítanak be a CAP alkalmazásával a tumor sejtekben. Ennek a reaktív szerek növekedése az a fő indíték, amely elindítja a daganatsejtek halálát. A konkrét válaszok itt az apoptózis, a növekedés gátlása, a sejtciklus leállítása, a DNS- és mitokondriális károsodás, valamint az immunogén sejthalál [110]. Az aktuális eredmény azonban dózisfüggő [111,112,113].

Keidar és munkatársai egy pilotkísérletet végeztek a CAP alkalmazásának tesztelésére a tumor kezelésében. Kezdetben azt tapasztalták, hogy a bőrmelanoma sejtvonalak leváltak a kultúraedényből a CAP alkalmazása után, és ez a számuk csökkenéséhez vezetett, míg az egészséges sejtvonalak ragaszkodtak [114]. A szerzők tanulmányukban azt mutatták be, hogy a kis daganatok CAP alkalmazása után elpusztultak, és az előrehaladottabb tumorok mérete csökkent az egér alhasi vese tumorainak vizsgálata során. Kaushik és munkatársai [115] bemutatták a ROS hatását a tumor sejtek elhalására a plazma kibocsátás hatásának értékelése során a T98G, A549, HEK293 és MRC5 sejtvonalakon. A szerzők kimutatták, hogy a HEK293 és MRC5 nem rosszindulatú sejtek életképességét minimálisan érintette a plazma kibocsátás, szemben a rák sejtvonalakkal. A plazma kibocsátás által létrehozott ROS és H2O2 megváltoztatta a mitokondriális membrán potenciálját. Ez elindította a belső apoptózis útvonalat, és eredményezte az összes pro-apoptotikus génexpresszió növekedését és az anti-apoptotikus génexpresszió csökkenését. Az ERK1/2/MAPK sejtsignalizációs aktivitásban is változás történt a fehérje szintjén. A létrejövő hatást ROS-elnyelőkkel lehet visszafordítani.

A ráksejtek a metabolikus szinten is különböznek az egészséges sejtektől. Itt a daganatsejtek metabolikus átprogramozása egyszerű szénhidrátokat alakít át makromolekulákba, különösen lipidbe, fehérjékbe és nukleinsav-makromolekulákba. Ez olyan köztes metabolitokat eredményez, amelyeket a tumoros sejtek a növekedéshez és a proliferációhoz használhatnak [116,117,118]. Xu és munkatársai [119] tanulmányozta a CAP hatásait a megváltozott daganatsejtek metabolikus aktivitására. KEGG és GC-TOFMS analíziseik rámutattak arra, hogy a leukémia sejtek más alanin, aszparaginsav és glutaminsav metabolizmussal rendelkeznek. A szerzők rögzítették a glutamináz tevékenység csökkenését is a CAP alkalmazása után a ráksejtekben. Ez csökkenti a glutamin átalakítását glutaminsavvá. A glutaminsav hiánya, egyidejűleg a glutamin felhalmozódásával a leukémia sejtekben a proliferáció gátlásához és akár a sejthalálhoz is vezethet [119].

A sejtvonalakon és állati modelleken végzett tanulmányok ismételten bizonyították a CAP eszközök előnyeit és az anti-tumor aktivitásukat. Egy tanulmány szerint a glioblasztóma sejtvonalak elvesztették életképességüket a plazmával történő kezelés után [120]. Ezen tanulmány azt is kimutatta, hogy a korábban a temozolomid alkiláló szertől rezisztens sejtvonalak érzékennyé váltak rá [120]. Ezenkívül több szerző is beszámolt arról, hogy a CAP expozíció elvesztést okozott az életképességben és indukált apoptózist más típusú agydaganat sejtvonalakban is [121,122,123].

A plazma kibocsátás után indukált apoptózist dokumentáltak a tüdőrák TC-1 sejtvonalakban. Ezt a fibroblaszt vonalakban is rögzítették, de sokkal kisebb mértékben [124]. Az utolsó tanulmány legfontosabb előnye az volt, hogy a plazmaeszközök méretét minimalizálva lehetővé vált a CAP könnyebb alkalmazása mélyebb elváltozásokban és szerkezetekben. Az apoptosis indukcióját itt a 125-440 μm átmérőjű eszközökből származó plazma kibocsátás váltotta ki. A µCAP eszközöket [125] közvetlenül egér agydaganatain és in vitro glioblasztoma sejtvonalakon is használták. Utóbbi esetben a 70 μm-es eszköz által kibocsátott plazma kibocsátás növelte a ROS és RNS szinteket, és ennek eredményeként jelentősen csökkent az U87MG glioblasztóma sejtek életképessége. Legfontosabbként az eszköz képes volt a plazma kibocsátásra egy intrakraniális endoszkópos cső segítségével az egerek agyában, aminek eredményeként a daganat növekedését gátló hatást értek el [125]. A szerzők optimalizálták az eszközparamétereket a leginkább megfelelő agyi és emlődaganatok kezelésére [126].

Az in vivo plazma hatása már bebizonyosodott állati modellekben, amelyeket a 4T emlősejtvonalak szubkután injektáltak. Ezek a sejtvonalak általános tumoros növekedését 250 μm átmérőjű CAP eszköz plazma kibocsátásának tették ki. Fontos megjegyezni, hogy a 3 perces plazma kezelés során elérték a tumor növekedésének csökkenését, amely hasonló volt a kemoterápiához. Az elemi és anti-apoptotikus génaktivitás arányában is szignifikáns változás történt a molekuláris szinten [127].

Mashayekh és munkatársai [128] tanulmányozta a CAP in vivo hatását egérmodelleken és az in vitro hatást a melanoma B16/F10 sejtvonalakon. Munkájuk során az állati modelleken tapasztalták a sejtvonalak többségének elvesztett életképességét és az állati modellek tumorának jelentős zsugorodását. A sejtvonal eredményeket a 3 perces CAP kezelés után 48 óra alatt érték el, és az in vivo tumor zsugorodása összehasonlítható volt a kemoterápia által elérttel. Összefoglalva, azon elemzések, amelyek a CAP hatásait vizsgálták a bőrdaganatok kezelésére, az elsők voltak, mert a plazmát legkönnyebben közvetlenül alkalmazzák a bőr szerkezeteire. Például a G361 melanoma sejtek elvesztették az életképességüket és leváltak a felszínről a CAP alkalmazása után. Ezeknek a sejteknek alacsonyabb integrin és FAK kifejeződése volt és megváltozott aktin filament struktúrájuk. Ez az eredmény alátámasztja azt a hipotézist, hogy a plazma által elősegített sejthalál összefüggésben lehet az integrin-ECM kölcsönhatásokkal [129]. Lehetőség nyílt a CAP antiproliferatív hatásának szelektív növelésére is melanoma sejtvonalakon arany-nanorészecskékkel kombinált plazmával, amelyhez az anti-FAK antitestek voltak kötve [130].

Az MCF-7 emlőrák sejtvonalakon is elvégeztek analíziseket. Az első eredmények azt mutatták, hogy a CAP kezelés után csökkent a sejtek életképessége az apoptózis növekedése miatt [22]. Ninomiya és mtsai. [131] később kimutatták, hogy a CAP sérülést okozott a rákos emlősejtvonalak 50%-ánál, függetlenül attól, hogy invazív MB-231 vagy nem invazív MCF-7 sejtvonalak voltak. Végül a CAP antiproliferatív hatásait az emberi emlősejtek metasztázisából származó sejtvonalakban is észlelték [131].

További kutatásokat végeztek a HCT-116, SW480 és LoVo vastagbélrák sejtvonalakon. Ezek a sejtek elvesztették életképességüket a CAP alkalmazás után [132], és ezt a hatást alacsonyabb sejtmobilitás és magasabb B-katenin foszforiláció kísérte. Ezenkívül, bár a CAP eszközt úgy tekintették, hogy az apoptózist akár 70%-os arányban is elősegíti a B16 és COLO320 vastagbél sejtvonalakban, nem volt hatása a makrofág sejtvonalak kontrollokra [133]. Ishaq és munkatársai [134] azt is kimutatták, hogy a CAP kezelés növelte az apoptózist a különböző vastagbél sejtvonalakban a Nox2-AKT1 útvonal aktiválásán keresztül. A szerzők azt is kimutatták, hogy bár a HT29 sejtvonalak túlnyomórészt ellenállnak a ROS közvetítette rákhalálnak, ezt az ellenállást csökkenteni lehet a Nrf2/Srx jelátvitel gátlásával. Végül a CAP expozíció antiproliferatív hatással bír többsejtes tumor spheroidokra, amelyek a tumorkörnyezetet utánozzák, és dózisfüggő módon. A CAP expozíciót követően megfigyelték a spheroid Ki67 vesztését és a felhalmozódott DNS-károsodást [135].

Az in vitro kísérleti eredmények azt is sugallják, hogy a CAP alkalmazás előnyös lehet nyak- és fejrákok esetében. Habár ezek a területeken lévő daganatok viszonylag könnyen eltávolíthatók, ez a beavatkozás gyakran invazív, és a CAP ezt a hatást csökkentheti. Guerrero-Preston és munkatársai [136] azt találták, hogy a CAP szintén antiproliferatív módon hatott ezekre a sejtekre. Bár ezek a szerzők úgy gondolták, hogy ez nem-apoptotikus folyamatok eredménye, ellentmondó tanulmányok arra utaltak, hogy az antiproliferatív hatás az apoptotikus kaskád aktiválásából származik [137,138].

Több tanulmány is vizsgálta a CAP alkalmazását a méhnyakrákok esetében, főleg a HeLa sejteken. Ezekben a sejtekben apoptotikus folyamatokat észleltek a CAP kezelést követően növekedett ROS és a JNK és p38 utakban bekövetkező változások miatt [139]. Ennek az hatásnak egy másik megfigyelt mechanizmusa az volt, hogy a membrán lipidek oxidációja a sejtösszeomlást okozta [140]. Ezenkívül, Tan és munkatársai [141] egy mikroeszközt használtak, mintegy 1 μm átmérőjű elektródával, és ez szelektív apoptózist váltott ki különböző HeLa sejtekben, anélkül, hogy a szomszédos sejteket érintette volna.

Az eszköz alkalmazásának lehetőségeit vizsgálták a leukémia sejtvonalakon is. Azonban a CAP klinikai körülmények között történő hipotetikus alkalmazása továbbra is tisztázatlan, és annak legjobb módszerének meghatározása további vizsgálatot igényel. Itt a CAP-aktivált folyadékok használata is szóba jöhet. Azonban a CAP alkalmazás in vitro sejthalált idézett elő a THP-1 leukémia sejtvonalakban dózisfüggő módon [142]. A CAP alkalmazás azonban irányíthatatlan nekrózist okozott [143]. A szerzők aztán azt mutatták ki, hogy a CAP expozíció után 45 másodperccel indukálódott a sejtes apoptózis, és a kezelés után több mint 50 másodpercig nekrózis figyelhető meg. Végül két független tanulmány is kimutatta az antiproliferatív hatásokat a hasnyálmirigysejteken [144,145].

A CAP kezelést közvetlenül alkalmazták emberi daganatokon is klinikai beállításokban [146]. Ebben a tanulmányban hat haladó nyak- és fejrákos páciens vett részt. Közülük két páciensnek csökkent a daganatmérete a CAP alkalmazását követően. Habár az egyik páciens legalább részleges remissziót és javulást ért el, a másik visszaesett és meghalt. Két páciens nem jelentett mellékhatást a CAP kezelés során, de a megmaradt négy száraz szájat tapasztalt. Legfontosabb, hogy négy páciens jelentős fájdalomcsillapítást tapasztalt. Ezek a páciensek azonban terminális stádiumban voltak, és az adatok értékelése végén öten elhunytak. Habár a hideg plasma alkalmazása nem fordította meg a betegség lefolyását, összességében pozitív hatással volt anélkül, hogy jelentős kárt vagy mellékhatást okozott volna.

A plazma kisütése közvetlenül és közvetve is befolyásolja a sejttenyészet közegét [25], és ez ösztönzi a CAP-aktivált plazma vagy más folyadék alkalmazásának megfontolását a daganatsejtek életképességének csökkentése érdekében. A plazma-aktivált közeg (PAM), a plazma-aktivált Ringer-laktát oldat (PAL) és más plazma-aktivált oldatok legnagyobb előnye az, hogy viszonylag hosszú ideig tárolhatók. Hipotetikusan azt is el lehet képzelni, hogy az aktivált folyadékokat viszonylag könnyen lehet alkalmazni belső szerkezetekre. A CAP-aktivált médiumok általában az ROS, RNS és H2O2 tartalmuk miatt indukálnak apoptózist [147]. Az eredmény azonban sejtspecifikus lehet, és attól függhet, hogy az adott sejtvonalban mennyi vízszállító található [148].

Az apoptotikus morfológiai változások különösen észlelhetők voltak glioblasztóma sejtvonalakban a CAP által kiváltott média alkalmazását követően. Emelkedett effektor kaspáz 3/7 aktivitást és csökkent AKT kináz expressziót is megfigyeltek molekuláris szinten [122]. Hasonló eredményeket kaptak gyomorrák sejtvonalak esetében is, amikor PAM hatott rájuk [149]. Ezek a sejtek apoptózissal kapcsolatos morfológiai változásokat kezdtek mutatni. A kaspáz 3/7 aktivitása nőtt, és az érintett csoportban az annexin V pozitív sejtek aránya két óra PAM expozíció után szignifikánsan magasabb volt, mint a kontroll csoportban. Az eksperimentális csoportban magasabb ROS szint is volt, de ezt ROS gyűjtőkkel lehetett megszüntetni. Ezenkívül azok a sejtek, amelyeket 1 × 104 számú sejtet tartalmazó jólbeültetéses lemezen ültettek be, ellenállást mutattak a PAM-mal szemben, de ez az ellenállás több mint két percig tartó expozíció után alábbhagyott. Ezen ellenálló sejtekben magasabb volt a CD44 variáns 9 kifejeződése. Ez a variáns fontos szerepet játszik a redukált glutation szintézisében, amely nélkülözhetetlen a szabad gyökök semlegesítéséhez és a megfelelő válaszokhoz a stresszjelekre [150].

Az ovariumrák sejtvonalak életképessége, amelyek ellenálltak a paclitaxel és ciszplatinnek, majdnem 30%-kal csökkent CAP kezelés után [151]. A szerzők elemzést is végeztek a CAP hatásairól egér xenograftokon. Számos kemorezisztens sejtvonalat kezdetben egerekbe oltottak be szérummentes közegbe és matrigelbe, majd 200 µL plazma-aktivált közeg és kezeletlen kontroll RPMI-1640 közeg lett beoltva. Sejtvonalaktól függően a daganatok 66%-kal és 52%-kal csökkentek 29 napon belül az első CAP injekciót követően a kontroll szintekhez képest. Ezenkívül a PAM alkalmazása növelte az ROS szinteket négyféle hasnyálmirigydaganat sejtvonal esetében is. Ez a sejtek apoptózisához vezetett, amit ROS gyűjtőkkel lehetett visszafordítani [145]. A tanulmány a PAM hatékonyságát is vizsgálta egér xenograftokon, és jelentős daganat tömegcsökkenést figyeltek meg 28 napon belül. Emellett a szerzők, Nakamura és munkatársai [152] azt találták, hogy in vivo PAM közeg expozíció egy másik egér xenograft modell esetében gátolta az ES2 ráksejtek peritoneális terjedését.

A PAM mellett a PAL is alkalmazható daganatellenes kezelésre. A PAL az in vitro körülmények között indukálja az apoptózist hasnyálmirigy sejtvonalakban a ROS szint növelésével és a sejtheadás csökkentésével. A PAL-nak daganatellenes hatása is volt az in vivo egér xenograft modellekben található hasi csomópontokra [153]. Emellett a PAL alkalmazása erős antiproliferatív hatást gyakorolt az A549 tüdőrák sejtvonalakra is [154]. Ebben a munkában a CAP alkalmazása mitokondriális diszfunkcióval járt, amely a NF-κB-Bcl2 molekuláris útvonal lefelé történő szabályozásával volt összefüggésben [154]. A szerzők úgy gondolták, hogy a PAL végső antiproliferatív hatása a daganatsejtvonalakon erősebb lesz, mint a PAM-é. Azonban ez a megfontolás vitára ad okot és további elemzést igényel. Függetlenül ettől az eredménytől a PAL legnagyobb előnye, hogy valószínűleg könnyebb alkalmazni jövőbeli klinikai vizsgálatok során, mivel jelenleg tenyésztett közeg nem használható orvosi kezelésre [154]. Habár ez megfelelő alternatívát kínál a jelenlegi módszerekhez képest, további tanulmányozást igényel. Végül, a PAM hatásairól szóló elemzéseket is folytatni kell a daganatsejtek esetében, annak ellenére, hogy lehetséges komplikációk merülhetnek fel alkalmazásával a klinikai vizsgálatok során. Ezek az elemzések további jelenségeket és elveket fedhetnek fel, amelyek előnyösek lehetnek a klinikai eljárások szempontjából.

A plazma alkalmazásának egyik legfejlettebb módja a daganatimmunterápia alkalmazása. Ez lehetséges, mert a rák kezdetét és lefolyását jelentősen befolyásolhatja az emberi immunrendszer. Az immunrendszer szabályozó képessége különösen képes felülkerekedni a ráksejtek képességén az immunválaszok elnyomására [155]. Ezek a szabályozások magukba foglalják különböző citokinok, sejtalapú terápiák és immunellenőrzési gátlók használatát is [147]. Továbbá, néhány sugár- és kemoterápiás eljárás immunogén sejthalált (ICD) vált ki [156,157]. A sugár- vagy kemoterápiával károsodott vagy megváltozott sejtek "károsodás-asszociált molekuláris minta jelek" (DMP) kibocsátását eredményezik. A DMP molekulák vezetik az immunrendszert ezeknek a sejteknek a megsemmisítésére. Ami még fontosabb, néhány tanulmány azt sugallja, hogy a CAP is kiválthatja az ICD-t, és ez a következő makrofágstimulációhoz vezet [38,158,159].

Miller és munkatársai [160] és Almeida [161] részletezte a plazma használatának elveit és lehetőségeit az immunterápiában. Különösen Lin és mtsai. munkájában [162] bemutatták, hogy a CAP az in vitro A549 tüdőrák és sugárzással szemben ellenálló nasopharyngealis karcinóma sejtvonalakban kiválthatja az ICD-t. Ebben az esetben az extracelluláris ATP kibocsátást az ICD makrofág stimuláció követte. Emellett a CAP növelte az extracelluláris ROS szinteket, ami a calreticulin termelés növekedéséhez vezetett. A CAP-alapú immunterápia ígéretes lehetőség a glioblasztóma multiforme kezelésére is. Ez egy nagyon agresszív ráktípus, amelyben az immunrendszer lefelé szabályozódik [161]. Végül Cheng és mtsai. [163] kiemelték a következőket: 1.) 30 másodpercnyi CAP stimuláció a makrofágokban megnövelt IL-6 és IL12 termelést eredményezett, és csökkent az anti-gyulladásos citokin IL-10 termelése, valamint 2.) az IL-2 és az IFN-g termelése megnőtt az egér lépőből származó izolált T-sejtvonalakban a CAP expozíció után. A szerzők megpróbálták a valós körülményeket szimulálni, amikor eltávolították az egérmodell nyirokcsomóit és kitették azokat a CAP-nak. Ezután izolálták a CD4+ T-sejteket mind a kontroll, mind az érintett nyirokcsomókból. Az érintett nyirokcsomókból származó sejtek növelt funkcióval rendelkeztek, amely a növelt IL-2 és IFN-g termelésben nyilvánult meg. A szerzők munkája azzal zárult, hogy megmutatták a hatékony daganatellenes hatást azokban az egerekben, akiknek az CAP-ral érintett T-sejteket ültették át a nyirokcsomóikba. Hatásai a CAP alkalmazásának különböző daganatsejtvonalakon.

Összefoglalás

A hideg plazmának jelentős potenciálja van a modern klinikai gyakorlatban való széles körű alkalmazásra. Az eddig elvégzett elemzések arra utalnak, hogy a hideg plazma alkalmazása előnyös volt számos orvosi területen, anélkül, hogy jelentős negatív hatást gyakorolt volna az egészséges sejtekre. Azonban a hideg plazma alkalmazása potenciálisan káros elemeket hozhat létre, és ezért szakértői irányítás mellett és megfelelő adagolással kell alkalmazni. Ezenkívül a hideg plazma alkalmazását nem csak a felszíni struktúrákra szabad korlátozni, mert a technológiai fejlesztések valószínűleg lehetővé teszik egyre kisebb eszközök kifejlesztését, amelyek alkalmasak a plazma kisütés alkalmazására belső struktúrákban.

Ezek a hideg plazma eljárások valószínűleg előnyösek lesznek azon belső szövetek kezelésében is, amellett, hogy a daganatkezelés területén is alkalmazhatók. Azonban a hideg plazma hatásairól szóló jelenlegi elemzések továbbra is csak sejtvonalakra és állatkísérletekre összpontosítanak. Bár ezek a kísérletek hozzáférhetőbbek és könnyebben kivitelezhetők, az emberi betegekben a hideg plazma hatásainak szélesebb körű vizsgálata fontos és előnyös lehet a rákkutatásban és a regeneratív medicina tanulmányokban. A hideg plazma rutin klinikai gyakorlatba való bevezetésének potenciálisan jelentős költségeket és költségeket csökkentő hatása lehet ezekre a kezelésekre. Legfontosabb, hogy a hideg plazma kezelési rendszere kevésbé invazív és stresszmentesebb lesz a páciensek számára.